Оптическое и геометрическое увеличение микроскопа

Полезное увеличение микроскопа

Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.


Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии , то угловое расстояние между изображениями этих точек . Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:. (6.12)

Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра (0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость: . (6.13)

Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом ( ). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза ( )

РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ оптических приборов, характеризует их способность давать раздельные изображения двух близко расположенных точек. Из-за дифракции света изображение точки представляет собой не строго точку, а кружок (светлое пятно, окруженное кольцами). Наименьшее угловое или линейное расстояние между двумя точками, при котором система дает их раздельное изображение, называется пределом разрешения и характеризует границы применимости геометрической оптики. Обратная величина есть разрешающая способность, которая прямо пропорциональна апертуре прибора; поэтому для повышения разрешающей способности оптические телескопы имеют большой диаметр объектива. Разрешающая способность зависит от длины волны, на которой работает прибор, поэтому разрешающая способность электронного микроскопа в 1000 раз больше разрешающей способности оптического микроскопа.

Иммерсия в микроскопии — это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.

оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая так жидкость называется иммерсионной.

Из основной формулы разрешающей способности микроскопа: d = 0,61λ/А, следует, что предел разрешения определяется длиной волны λ и числовой апертурой объектива А. Так как не всегда возможно изменить длину волны, то для достижения лучшего разрешения стремятся применять объектив, имеющий большую числовую апертуру.

Однако для «сухого» объектива, с показателем преломления среды перед его передней линзой n=1, максимальное значение числовой апертуры объектива не может превысить значение около 0,95.

Для решения этой проблемы берут иммерсионную жидкость, показатель преломления которой n2 и показатель преломления фронтальной линзы n3 выбраны определённым образом. Исходящие от одной точки объекта OP лучи проходят без преломления через иммерсионную пленку и могут «приниматься» фронтальной линзой объектива.

В этом случае числовая апертура увеличивается, а предел разрешения уменьшается в n2 раз.

Возникающие на поверхностях покровного стекла и фронтальной линзе объектива паразитные отражения существенно меньше, нежели у «сухих» объективов, а в некоторых случаях паразитные рефлексы могут быть полностью устранены. Это улучшает контраст изображения и позволяет поднять освещённость препарата без вредного влияния на изображение.

Толщина слоя жидкости между объективом и препаратом может меняться, и за счет этого можно в некоторых пределах изменять компенсацию сферической аберрации.

http://aco.ifmo.ru/el_books/introduction_into_specialization/glava-6/glava-6-2.htmlhttp://studopedia.ru/4_14992_opticheskaya-sistema-mikroskopa.htmlhttp://lektsii.org/15-26479.html

Типы микроскопов

От самого первого до инструмента, доступного сегодня, есть большая разница в технологии. Сегодня существуют различные виды микроскопов, которые способны увеличить объект в значительной степени. Они различаются по увеличению, разрешению, способу освещения, типу объекта, формированию изображения, глубине резкости и т. д.

Составной

Вид микроскопа – составной, обыкновенно используется в учебных заведениях и входит в категорию чаще всего применяемых в биологии. Он имеет две линзы, а именно объектив и окулярную линзу и обеспечивает увеличение 1500-х. Объектив окуляра имеет увеличение 10-х или 15-х. Инструмент используется для наблюдения за бактериями, простейшими, различными клетками и т. д. Некоторые используют естественный свет, в то время как другие имеют осветитель, прикрепленный к основанию, который действует как источник света.

Образец помещают на площадку и наблюдают через линзы, которые имеют различную силу увеличения.

Световой

Вид микроскопа – световой, также называют оптическим. Объектив окуляра 10-х или 16-х и обеспечивает увеличение до 1500-х. Применяют при изучении анатомии и физиологии мельчайших существ.

Препаровальный


Его еще называют стереомикроскопом. Его сила увеличения меньше, чем другие типы микроскопов, но он дает трехмерную картину. Из-за низкой увеличительной мощности они используются для наблюдения небольших объектов. Необходимы в хирургических операциях, вскрытии, криминалистике и т. д.

Цифровой

Тип микроскопа – цифровой, имеет цифровую камеру, которая крепится к монитору. Он имеет оптическую линзу, а также датчики и обеспечивает увеличение в 1000 раз. Используется для получения снимков объекта с высоким разрешением.

Электронный

Электронный имеет высокое разрешение чем другие типы микроскопов. Строение устройства сложное и имеет схему испускающую пучок электронов, которые сталкиваются с объектом. Это один из лучших видов, используемых для изучения клеток.

Они бывает двух типов: сканирующий электронный и просвечивающий. Некоторые работают в вакууме, что снижает вероятность столкновения электронов с другими молекулами воздуха.

Просвечивающий электронный

Обеспечивает достаточно высокий уровень увеличения используя электронный луч дающий 2-мерное изображение. Электроны ударяют в объект, который делает его видимым. Объект виден темным на светлом фоне.

Сканирующий электронный

Это разновидность типа электронного микроскопа. Он имеет ниже увеличение, чем просвечивающий электронный, но может получить трехмерное изображение.

Фазовый контрастный

Эти виды микроскопов работают с помощью специального светового конденсатора. Свет падает на объект с разной скоростью. В этом устройстве можно увидеть неокрашенные и живые микроорганизмы. Также можно наблюдать различные части клетки, такие как митохондрии,лизосомы, тела Гольджи, ядра и т. д.

Люминесцентный

Этот тип микроскопа работает с помощью ультрафиолетового света. Ультрафиолетовый свет освещает образец и возбуждает электроны объекта, которые можно увидеть в разных цветах. Для подсветки объекта используются флуоресцентные красители. Ультрафиолетовый свет увеличивает разрешение, что полезно для идентификации микроорганизмов.

Принципы устройства

Главными компонентами микроскопа являются:

Система оптического микроскопа включает в себя ряд компонентов, основным из которых является объектив.

  Оптика микроскопа состоит из двух элементов — окуляра и объектива которые закреплены в подвижном тубусе, находящимся на металлическом основании с предметный столиком. Увеличение микроскопа без дополнительных линз между окуляром и объективом равно произведению их увеличений В наше время в микроскопе почти всегда есть система освещения и микро и макро винтами для настройки резкости. В зависимости от назначения к исследовательскиму микроскопу могут прилагаться дополнительные системы и устройства, такие как объективы с увеличеным разрешением 40, апертурой 0,65, коррекцией на толщину покровного стекла 0,17 мм и бесконечную длину тубуса

Объективы оптического микроскопа являются одной из главных частей и представляют собой сложный механизм для увеличения изображения изучаемого предмета.  Увеличенное с помощью оптического объектива изображение предмета рассматривается через окуляр, который также в свою очередь может создавать увеличение. Если объектив микроскопа каким-то образом искажает изображение, то это искажение будет усилено окуляром. Объектив микроскопа это сложная оптическая система, увеличевающее изображение объекта. Она является наиболее ответственной и основной частью исследовательского оборудования. Рассмотреть изображение созданное объективом, можно через окуляр.

Объективы исследовательских и других микроскопов кисключая стереоскопические в большей степени взаимозаменяемые и унифицированые. На взаимную заменяемость в первую очередь влияют присоединительные параметры объектива.

Объектами исследований микроскопов могут являться любые органические и не органические предметы, живые и не живые ткани, целые биологические организмы или их отдельные части.

Микроскоп имеет в качестве осветительной оптической системы галогеновую лампу или светодиодную систему. Достоинством светодиода является крайне долгое время работы, по сравнению с обычными галогеновыми лампами (в 100 и более раз превышающее данный показатель); малое энергопотребление (составляющее от 1/3 до 1/10 энергопотребления обычной лампы); спектральная “чистота” и т.д.

Технические хитрости

Рисунок 2. Основные параметры, определяющие разрешение объектива: n — коэффициент преломления иммерсионной жидкости и α — апертурный угол объектива.


Очевидно, что такого разрешения недостаточно для детального изучения структуры и процессов, происходящих на субклеточном уровне. Так, например, размеры рибосом, ядерных пор, АТФ-синтаз, клеточных филаментов, микротрубочек и других надмолекулярных структур не превышают 150 нм. Толщина биологических мембран составляет не более 10 нм. Электронная микроскопия позволяет достигнуть необходимого разрешения, но она не пригодна для работы с живыми клетками из-за высокой разрушающей и ионизационной способности, а также предполагает напыление тонких слоев металла или углерода, что может изменить исходные свойства объекта. Атомно-силовая микроскопия «близорука» и не позволяет проникнуть вглубь объекта более чем на 10–20 нм.

Взамен атомно-силовая микроскопия, конечно, обладает другими уникальными свойствами: «Атомно-силовая микроскопия: увидеть, прикоснувшись» . — Ред.

Важной особенностью живых клеток и тканей является низкий контраст внутренних структур, которые в основном прозрачны. Для их идентификации необходимо специфическое окрашивание, в том числе с применением различных флуорофоров (органических молекул, флуоресцентных белков или квантовых точек)

Таким образом, флуоресцентная микроскопия сочетает в себе сразу несколько преимуществ. Во-первых, возможность прижизненного изучения объектов и наблюдения процессов в реальном времени. Во-вторых, возможность специфического мечения тканей, клеток, органелл и отдельных молекул. В-третьих, доступное на данный момент разнообразие флуоресцентных красителей и белков позволяет изучать одновременно несколько мишеней .

Существует достаточно много технологий, основанных на различных физических феноменах, позволяющих увеличить разрешение как в латеральном, так и аксиальном направлениях. Ближнепольная сканирующая микроскопия (микроскопия без использования линз) преодолевает дифракционный предел (разрешение порядка 20–50 нм), но позволяет изучать только поверхностные свойства объекта . Однако биологические объекты трехмерны, и с увеличением толщины объекта свет от разных слоев будет затруднять интерпретацию изображения конкретного оптического среза. Известно несколько методов микроскопии дальнего поля, значимость которых в первую очередь определяется заметным улучшением разрешения вдоль оси Z.

В конфокальном микроскопе применяется апертура в фокальной плоскости объектива, пропускающая свет только от объектов, находящихся в фокусе . Мультифотонная микроскопия основана на возможности двухфотонного или трехфотонного возбуждения флуоресценции. Например, флуорофор, обычно поглощающий ультрафиолетовое излучение (≈350 нм), может быть возбужден двумя красными фотонами (≈700 нм), если они достигли флуорофора одновременно (поглощение будет зависеть от квадрата интенсивности возбуждающего излучения). Это значит, что необходима высокая плотность фотонов для возбуждения флуоресценции. Достаточная плотность достигается в фокусе, поэтому возбуждение флуоресценции происходит только в фокальной плоскости . В I5M- и 4Pi-микроскопии применяются два объектива для возбуждения и/или регистрации флуоресценции, что позволяет освещать и регистрировать флуоресценцию с двух сторон от образца и заметно увеличить разрешение вдоль оптической оси (до 100 нм) .

Рисунок 3. Микроскопия структурированного освещения. На трех исходных изображениях (а—в) видно, что при перемещении решетки (обозначено черной линией) интенсивность флуоресценции объектов, расположенных в фокусе, заметно меняется. Флуоресценция, исходящая от других оптических слоев, практически не меняется (обозначено белой стрелкой), что позволяет избавиться от нее за счет компьютерной обработки (г).

Все перечисленные выше методы не преодолевают дифракционный предел как таковой. Сочетая сразу несколько из них, вдоль осей XYZ возможно увеличить разрешение максимум в два раза, но оно по-прежнему будет зависеть от λ и α .

Классификация по принципу построения изображения

В лабораторных микроскопах наблюдатель видит отраженный или проходящий через свет не всегда так, как если бы он смотрел невооруженным глазом. Луч света может быть подвергнут изменению, как по форме, так и по длине волны или другим свойствам. В связи с этим, выделяют несколько видов лабораторных микроскопов по принципу построения изображения:

  • Метод светлого поля. Для обычного человека это наиболее удобная форма восприятия объекта: светлый фон и темное изображение. Используется в микроскопах проходящего света, поэтому наблюдатель получает то же самое изображение, но в увеличенном виде. Изменения могут вызываться только применением  светофильтров из цветного стекла, которые надеваются на объектив. Реже используются интерференционные светофильтры, которые пропускают только определенную длину волны.
  • Метод темного поля. В этих микроскопах все наоборот: темный фон и более светлое изображение либо яркий блестящий контур исследуемого объекта. Достигается это разными способами в зависимости от типа микроскопа. В проходящих падающий свет перекрывается до того момента, как он попадет на объект. В приборах отраженного света луч проходит через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, который по своему размеру превышает выходной зрачок объектива.
  • Метод фазового контраста. Эти микроскопы, которые иногда так и называют – фазовые, — позволяют получить изображения с четко выраженными внешними и внутренними границами. Этот метод хорошо подходит для изучения клеток и тканей.
  • Люминесцентные микроскопы. Их принцип действия строится на свойствах некоторых веществ возбуждать собственное излучение под действием ультрафиолетовых или сине-фиолетовых лучей. Соответствующий яркий источник света направляется на объект, а новые лучи от него «отсекаются» сложной системой светофильтров до получения излучения только определенной длины волны.
  • «Иммерсионные» микроскопы. Эти приборы используются для сложных медико-биологических исследований, где нужно получить контрастное изображение объекта на фоне схожего оттенка. Прямой проходящий свет перекрывается в два этапа: часть до объекта, вторая часть – после объекта с ослаблением.
  • Микроскопы интерференционного (или дифференциально-интерференционного) контраста. Позволяют получить на однотонном фоне объемное изображение того же цвета. Для разделения изображения и фона используется окантовка другого цвета.
  • Ультрафиолетовые и инфракрасные микроскопы. В них освещение и формирование изображения происходит на длинах волн, невидимых для человеческого глаза. Соответственно, для удобства наблюдений такие микроскопы подключаются к компьютеру, который конвертирует изображение.

Современные лабораторные микроскопы далеко не всегда строятся по какому-либо одному принципу. Для лаборатории экономически невыгодно приобретать десятки моделей приборов для разных наблюдений, поэтому сейчас микроскопы выпускаются в модульном исполнении для формирования разных способов построения изображений. Кроме того, многие можно подключать к компьютеру для записи и обработки информации.

Оптика не стареет

Как выяснилось во второй половине XX века, оптическим микроскопам еще есть куда развиваться. Решающим моментом в биологических и медицинских исследованиях стало появление флуоресцентных красителей и методов, позволяющих избирательно помечать определенные вещества. Это не было «всего лишь новой краской», это был настоящий переворот.

Вопреки расхожему заблуждению, флуоресценция — это вовсе не свечение в темноте (последнее называется люминесценцией). Это явление поглощения квантов определенной энергии (скажем, синего света) с последующим излучением других квантов меньшей энергии и, соответственно, иного света (при поглощении синего испускаться будут зеленые). Если поставить светофильтр, который пропускает только излучаемые красителем кванты и задерживает свет, вызывающий флуоресценцию, можно увидеть темный фон с яркими пятнами красителей, а красители, в свою очередь, могут расцвечивать образец чрезвычайно избирательно.

Например, можно покрасить цитоскелет нервной клетки красным, синапсы выделить зеленым, а ядро — голубым. Можно сделать флуоресцентную метку, которая позволит обнаружить белковые рецепторы на мембране или синтезируемые клеткой в определенных условиях молекулы. Метод иммуногистохимического окрашивания совершил революцию в биологической науке. А когда генные инженеры научились делать трансгенных животных с флуоресцентными белками, этот метод пережил второе рождение: реальностью стали, например, мыши с окрашенными в разные цвета нейронами.

Кроме того, инженеры придумали (и отработали на практике) метод так называемой конфокальной микроскопии. Суть его заключается в том, что микроскоп фокусируется на очень тонкий слой, а специальная диафрагма отсекает создаваемую объектами вне этого слоя засветку. Такой микроскоп может последовательно сканировать образец сверху вниз и получать стопку снимков, которая является готовой основой для трехмерной модели.

Использование лазеров и сложных оптических систем управления лучом позволило решить проблему выгорания красителей и высыхания нежных биологических образцов под ярким светом: луч лазера сканирует образец только тогда, когда это необходимо для съемки. А чтобы не тратить время и силы на осмотр большого препарата через окуляр с узким полем зрения, инженеры предложили автоматическую систему сканирования: на предметный столик современного микроскопа можно положить стекло с образцом, и прибор самостоятельно отснимет масштабную панораму всего образца. При этом в нужных местах он будет наводить на резкость, а затем склеит множество кадров воедино.

В некоторые микроскопы можно посадить живых мышей, крыс или хотя бы мелких беспозвоночных животных. Другие дают небольшое увеличение, зато совмещены с рентгеновским аппаратом. Многие для устранения помех от вибраций монтируются на специальных столах массой в несколько тонн внутри помещений с тщательно контролируемым микроклиматом. Стоимость подобных систем превышает стоимость иных электронных микроскопов, а конкурсы на самый красивый кадр давно стали традицией. Кроме того, продолжается и совершенствование оптики: от поиска лучших сортов стекла и подбора оптимальных комбинаций линз инженеры перешли к принципиально новым способам фокусировки света.

Мы специально перечислили ряд технических подробностей для того, чтобы показать: прогресс в области биологических исследований давно связан с прогрессом в других областях. Если бы не существовало компьютеров, способных автоматически сосчитать число окрашенных клеток на нескольких сотнях фотографий, толку от супермикроскопов было бы немного. А без флуоресцентных красителей все миллионы клеток были бы неотличимы друг от друга, так что проследить за формированием новых или гибелью старых было бы практически невозможно.

Микроскопы компании Nikon

Микроскопы торговой марки Nikonзанимают высшую ступеньку.  Это современные микроскопы, в которых конструкторы интегрировали самые новые и современные инновационные технические решения и возможности мировой науки и техники.


По сфере применения микроскопы компании Nikon подразделяются на следующие группы:

  • биологический микроскоп;
  • стереомикроскопы.

Биомедицинские или биологические микроскопы Nikon используются для современных биологических и медицинских исследований по изучению живых организмов и объектов, а также для автоматизированных и многоцелевых лабораторных анализов.

Среди биомедицинских Nikon выделяются следующие модельные ряды:

  • Микроскоп Nikon Eclipse Е;
  • Микроскоп Nikon Eclipse Ci;
  • Микроскоп NikonNi;
  • Микроскоп NikonTi.

Стереомикроскопы Nikon позволяют оператору наблюдать трёхмерный объект исследования с возможностью получения вполне естественного изображения.

Среди стереомикроскопов Никон выделяются следующие серии моделей:

  • Микроскоп Nikon SMZ1270/1270i;
  • Микроскоп Nikon SMZ800N;
  • Микроскоп Nikon SMZ25/SMZ18;
  • Микроскоп Nikon SMZ745/745T;
  • NikonSMZ660;
  • NikonSMZ445/460.

Документация(фиксирование) изображения.

Интеграция современных микроскопов Nikon с цифровыми камерами позволяет вести непрерывное наблюдение за рассматриваемыми объектами с одновременной фиксацией и записью их изображений. Цифровые камеры, в настоящее время широко применяются для наблюдений за живыми организмами, а также в других отраслях науки и техники.

Компания Nikon выпускает следующие цифровые камеры:

Nikon DS-Fi2                 Nikon DS-Qi1                   Nikon DS-Vi1              Nikon DS-Fi1c           Nikon DS-Ri1

  • цифровую камеру Nikon DS-Fi2;
  • цифровую камеру Nikon DS-Qi1;
  • цифровую камеру Nikon DS-Vi1;
  • цифровую камеру Nikon DS-Fi1c;
  • цифровую камеру NikonDS-Ri1.

Оптическое увеличение системы

Когда мы работаем с лабораторным или стереоскопическим микроскопом, подсчет текущего увеличения системы не составляет труда. Необходимо перемножить увеличение всех оптических компонентов системы. Обычно, в случае стереомикроскопа это объектив, трансфокатор или увеличительный барабан и окуляры. В случае обычного лабораторного микроскопа дело обстоит еще проще – общее увеличение системы = кратность окуляров умноженная на кратность объектива, установленного в рабочую позицию

Важно помнить, что иногда встречаются специфические модели тубусов микроскопа, имеющие увеличивающий или уменьшающий фактор (особенно распространено для старых моделей микроскопов Leitz). Также, дополнительные оптические компоненты, будь то источник коаксиального освещения в стереомикроскопе или промежуточный адаптер для камеры, располагающийся под тубусом, могут иметь дополнительный фактор увеличения

Дополнительные оптические компоненты иногда имеют свой фактор увеличения, отличный от 1. В данном случае, коаксиальный осветитель (поз. 2) стереомикроскопа Olympus SZX16 имеет дополнительный увеличивающий фактор 1,5х.

К примеру, стереомикроскоп Olympus SZX-16 с окулярами 10х, объективом 2х, трансфокатором в позиции 8х и блоком коаксиального освещения с фактором 1,5х будет обладать общим оптическим увеличением 10х2х8х1,5 = 240 крат.

Под оптическим увеличением (Г) в таком случае следует понимать отношение тангенса угла наклона луча, вышедшего из оптической системы в пространство изображений, к тангенсу угла сопряженного ему луча в пространстве предметов. Либо отношение длины, сформированного оптической системой изображения отрезка, перпендикулярного оси оптической системы, к длине самого отрезка

Увеличение

Увеличение микроскопа полезно при изучении биологических структур, особенно на клеточном уровне. Увеличение масштаба для четкого наблюдения того, что мы не можем видеть невооруженным глазом, позволяет нам исследовать формы жизни, как растительные, так и животные, и понять их функции.

Увеличение на микроскопе означает величину или степень увеличения наблюдаемого объекта. Он измеряется кратными числами, такими как 2-x, 4-x и 10-x, что указывает на то, что объект увеличен в два раза, в четыре раза или в 10 раз соответственно. Увеличение должно быть тщательно отрегулировано пропорционально расстоянию.

Чем выше увеличение, тем ближе объектив должен быть расположен к наблюдаемому объекту. Большинство микроскопов позволяют регулировать расстояние между объективом и объектом, а также обеспечивают заранее заданные положения по умолчанию, которые помещают линзы с более высоким увеличением ближе к объекту.

Увеличение регулируется как на окулярах, так и на линзах большинства типов микроскопов. Наиболее распространенными линзовыми увеличениями для типичных лабораторных микроскопов являются 4-x, 10-x и 40-x, хотя существуют альтернативы с более меньшим или большим.


С этим читают